Untersuchungen zur Struktur doppelsträngiger DNA mit ungepaarten Nukleotiden in einem Strang

Diplomarbeit vorgelegt von Christoph Gohlke, Georg-August-Universität Göttingen, 1993.

Wissenschaftliche Betreuer: Robert M. Clegg, Stephan Diekmann, Hans-Joachim Fritz

Zusammenfassung

Aus den in dieser Arbeit vorgestellten fluoreszenzspektroskopischen Untersuchungen an doppelsträngigen Oligodesoxynukleotiden mit einer variablen Zahl ungepaarter Adenosin-Nukleotide in einem Strang (“bulges”), die 5'-endständig mit Fluorescein und Rhodamin markiert sind, können folgende Aussagen abgeleitet werden:

Messungen des Energietransfers zwischen den Farbstoffen sind konsistent zu einer von der Zahl der ungepaarten Nukleotide abhängigen starren Biegung der Moleküle. Jedes zusätzliche Nukleotid bis zu einer Zahl von 7 erhöht demnach den Biegewinkel. Moleküle mit 9 extrahelikalen Nukleotiden scheinen gegenüber den Molekülen mit 7 zusätzlichen Nukleotiden einen etwas verringerten Biegewinkel aufzuweisen.
Ein geometrisches Modell eines Knicks in einem doppelsträngigen DNA-Molekül erlaubt unter Berücksichtigung der Position von Fluorescein und Rhodamin an den Enden der DNA die Abschätzung der Biegewinkel aus den gemessenen Energietransfereffizienzen. Nach diesem Modell bewirkt eine 3 Nukleotide lange Schleife eine Biegung der Helixachse um 60±10° und eine 7 Nukleotide lange Schleife eine Biegung um 95±10°.
Die ungepaarten Nukleotide führen zu einer Destabilisierung der Moleküle, deren Ausmaß direkt abhängig von ihrer Anzahl ist. Aus der Temperaturabhängigkeit verschiedener fluoreszenzspektroskopischer Parameter der endständig gebundenen Farbstoffe folgt, daß in Molekülen mit größeren Schleifen die doppelsträngigen Bereiche weitgehend unabhängig voneinander schmelzen.
Die Bindung von (dT)10 an eine 9 Basen lange extrahelikale Schleife komplementärer Sequenz ist stark temperaturabhängig und führt zum Schmelzen des sehr kurzen doppelsträngigen Bereichs des “bulge”-Moleküls. Durch die Bindung werden also die den extrahelikalen Nukleotiden benachbarten Basenpaare destabilisiert.
Es wurden Abhängigkeiten spektroskopischer Parameter der Farbstoffe von Form und Zustand des Nukleinsäuremoleküls, an das sie gebunden sind, aufgezeigt, die eine wichtige Grundlage für die Planung und Durchführung weiterer fluoreszenz-spektroskopischer Untersuchungen zur Struktur und Stabilität von Nukleinsäuren darstellen.

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der Abkürzungen
Verzeichnis der Symbole und Konstanten

Einleitung
1. Strukturelle Elemente in Nukleinsäuren
2. Vorkommen doppelsträngiger Nukleinsäuren mit ungepaarten Nukleotiden in einem Strang
3. Struktur und Stabilität von “bulges”
  1. Die lokale Struktur
  2. Die Biegung des Doppelstrangs
  3. Thermodynamik
4. Konzeption der Arbeit
Material und Methoden
1. Synthese und Reinigung farbstoffmarkierter Oligonukleotide
  1. Oligonukleotidsynthese
  2. Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen
  3. Herstellung von Doppelsträngen
  4. Vorbereitung der Proben für spektroskopische Messungen
  5. Puffer und Lösungen
2. Grundlagen der Fluoreszenzspektroskopie
  1. Absorption und Emission
  2. Fluoreszenz-Polarisation
  3. Fluoreszenz-Löschung
  4. Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer
3. Spektroskopische Messungen
  1. Absorptionsspektroskopie
  2. “Steady-state”-Fluoreszenzspektroskopie
4. FRET-Messungen an farbstoffmarkierten Oligonukleotiden
  1. Messung der erhöhten Akzeptorfluoreszenz
  2. Bestimmung von E aus Emissionsanisotropien
5. Theorien des Helix-Coil-Übergangs
  1. “Two state”-Theorie
  2. Die Matrix-Methode
  3. Schleifen-Wichtungsfunktion
  4. Bestimmung von Schmelzkurven
6. Molekülgrafik und Molekülgeometrie-Rechnungen
Experimente und Ergebnisse
1. Charakterisierung der farbstoffmarkierten Oligonukleotide
  1. Design der Oligonukleotide
  2. Absorptionsspektren
  3. Fluoreszenzspektren
  4. Emissionsanisotropien
2. Bestimmung von Energietransfereffizienzen
  1. Analyse der erhöhten Akzeptorfluoreszenz
  2. Bestimmung von E aus Emissionsanisotropien
  3. Titrationen mit NaCl
3. Molekülgeometrie-Rechnungen
  1. Geometrische Beschreibung eines helikalen Knicks
  2. Ein Modell der Lage von Fluorescein und Rhodamin an DNA
  3. Abhängigkeit des Farbstoffabstands von den Biegewinkeln
4. Bestimmung und Auswertung von Schmelzkurven
  1. Energietransfereffizienzen
  2. Fluoreszenzintensität des Donors
  3. Intensität der Rhodaminemission
  4. Anisotropie der Rhodaminemission
  5. UV-Absorption
  6. Auswertung der Schmelzkurven
  7. Simulation von Schmelzkurven
5. Bindung von (dT)10 an A9FCRh18
  1. Titrationen
  2. Temperaturabhängigkeit der (dT)10 Bindung
6. Tabellarische Zusammenfassung einiger Messergebnisse
Diskussion
1. Energietransfer-Messungen
  1. Charakterisierung der farbstoffmarkierten Oligonukleotide
  2. Die Quantenausbeute des Donors
  3. Der Orientierungsfaktor
  4. Die Lage von Fluorescein und Rhodamin an der DNA
  5. Vergleich der gemessenen Energietransfereffizienzen
2. Bestimmung und Auswertung von Schmelzkurven
  1. Vergleich der verschiedenen Parameter
  2. Die Stabilität von “bulges”
3. Bindung von (dT)10 an die ungepaarten Basen des A9FCRh-Moleküls
4. Ausblick
Zusammenfassung
Literaturverzeichnis